Test toksyczności w diagnostyce błonicy – metody wykrywania toksyny

Wykrywanie produkcji toksyny błoniczej stanowi najważniejszy element laboratoryjnej diagnostyki błonicy. Samo wyizolowanie bakterii Corynebacterium diphtheriae nie jest wystarczające do potwierdzenia rozpoznania, ponieważ nie wszystkie szczepy tej bakterii produkują toksynę odpowiedzialną za objawy chorobowe¹².

Test Elka – złoty standard diagnostyki

Test Elka (i jego zmodyfikowana wersja) jest uznawany za złoty standard w diagnostyce błonicy i pozostaje podstawowym zalecanym testem diagnostycznym umożliwiającym wykrycie głównego czynnika chorobotwórczości Corynebacterium diphtheriae³⁴. Test ten wykrywa rozwój paska immunoprecypitacji na papierze filtracyjnym nasączonym antytoksyną, który jest następnie układany na podłożu agarowym z badaną bakterią⁵.

Mechanizm działania testu Elka opiera się na reakcji immunoprecypitacji między toksyną produkowaną przez bakterię a swoistą antytoksyną. Jeśli badany szczep produkuje toksynę błoniczą, w miejscu spotkania się toksyny z antytoksyną powstaje charakterystyczny pasek precypitacji, który potwierdza toksyczność szczepu⁶.

Obecnie w Stanach Zjednoczonych tylko CDC (Centers for Disease Control and Prevention) przeprowadza test Elka, dlatego laboratoria stanowe i lokalne powinny przesyłać próbki lub izolaty Corynebacterium diphtheriae do CDC w celu diagnostyki potwierdzającej¹. Pomaga to zapewnić podjęcie odpowiednich działań zdrowia publicznego.

Wyzwania związane z testem Elka

Głównym wyzwaniem w stosowaniu testu Elka jest ograniczona dostępność antysyvorotki błoniczej oraz malejące doświadczenie nawet w laboratoriach referencyjnych z powodu niskiej częstości występowania błonicy w krajach rozwiniętych². Te ograniczenia sprawiają, że wykonanie testu staje się coraz trudniejsze i kosztowne.

Dodatkowo, test Elka wymaga specjalistycznej wiedzy i doświadczenia w interpretacji wyników, co może być problematyczne w laboratoriach, które rzadko mają do czynienia z diagnostyką błonicy. Dlatego kluczowa jest współpraca z laboratoriami referencyjnymi, które mają odpowiednie doświadczenie i zasoby⁷.

Metody molekularne – PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) stanowi szybką i czułą metodę wykrywania sekwencji DNA kodującej podjednostkę A toksyny błoniczej⁵⁸. Metoda ta pozwala na znacznie szybsze uzyskanie wyników w porównaniu z tradycyjnym testem Elka.

Wykrywanie genu toksyny błoniczej metodą PCR odbywa się obecnie w wielu laboratoriach, w tym w PHO (Public Health Ontario), gdzie testy przeprowadza się co wtorek i czwartek, a czas oczekiwania wynosi 3 dni po potwierdzeniu identyfikacji izolatu⁹.

Jednak istotnym ograniczeniem metod PCR jest fakt, że wykrywają one jedynie obecność genu tox, ale nie dostarczają informacji o faktycznej produkcji toksyny przez bakterię¹¹⁰. Dlatego testy identyfikujące Corynebacterium diphtheriae lub wykrywające gen tox, ale niepotwierdzające produkcji toksyny, są niewystarczające do potwierdzenia diagnozy błonicy.

Konieczność potwierdzenia produkcji toksyny

Ze względu na to, że PCR wykrywa tylko gen kodujący toksynę błoniczą, ale nie potwierdza jej faktycznej produkcji, konieczne jest przeprowadzenie testu Elka we wszystkich izolatach dodatnich pod względem tox w celu potwierdzenia, czy szczep jest toksyczny¹⁰. Laboratoria diagnostyczne zaleca się, aby przesyłały izolaty dodatnie pod względem tox do Narodowego Laboratorium Referencyjnego w celu potwierdzenia produkcji toksyny błoniczej za pomocą testu Elka⁷.

W praktyce oznacza to, że proces diagnostyczny składa się z kilku etapów: izolacji i identyfikacji bakterii, wykrycia genu tox metodą PCR, a następnie potwierdzenia faktycznej produkcji toksyny testem Elka¹. Dopiero ukończenie wszystkich tych etapów pozwala na ostateczne potwierdzenie diagnozy błonicy.

Inne metody wykrywania toksyny

Oprócz testu Elka i PCR, w literaturze naukowej opisano różne inne metody wykrywania toksyny błoniczej². Do metod alternatywnych należą testy immunoenzymatyczne (EIA), kontrimmunelektroforeza oraz różne metody amplifikacji izotermicznej, takie jak LAMP⁵⁸.

Szczególnie obiecujące są immunochromatograficzne testy paskowe (ICS) oraz testy immunofluorescencyjne (LFIA) do wykrywania toksyny, a także metody amplifikacji izotermicznej do wykrywania genu tox¹⁰. Te nowoczesne metody mogą w przyszłości stanowić alternatywę dla tradycyjnych metod diagnostycznych.

Przyszłość diagnostyki toksyczności

Rozwój nowych metod wykrywania toksyny błoniczej koncentruje się na stworzeniu testów, które byłyby niezależne od dostępności antysyvorotki błoniczej, łatwe do wykonania i interpretacji, szybkie oraz możliwe do zastosowania jako testy punktu opieki⁷. Takie testy są szczególnie potrzebne w przypadku podejrzenia ogniska epidemicznego oraz w krajach, gdzie przypadki błonicy występują bardzo rzadko.

Idealne testy powinny również być łatwe do przechowywania i utrzymywania aktywności przez długi czas, ponieważ przypadki błonicy występują bardzo rzadko w niektórych krajach, ale gdy się pojawią, wymagają szybkiej i precyzyjnej diagnostyki⁷.