Hodowla bakteryjna w diagnostyce błonicy – metody laboratoryjne

Hodowla bakteryjna stanowi fundament laboratoryjnej diagnostyki błonicy, umożliwiając izolację i identyfikację Corynebacterium diphtheriae. Proces ten wymaga zastosowania specjalistycznych technik i podłoży hodowlanych, które są niezbędne do prawidłowego wzrostu tej wymagającej bakterii¹².

Pobieranie materiału do hodowli

Prawidłowe pobranie materiału do hodowli jest kluczowym elementem diagnostyki błonicy. W przypadku błonicy oddechowej należy pobrać wymazy z gardła i nosa, ze szczególnym uwzględnieniem krypt migdałkowych oraz wszelkich przebarwionych lub owrzodzonych obszarów³. Materiał powinien być pobierany spod charakterystycznej błony lub może zostać przesłana część samej błony do badania⁴.

Do pobierania próbek używa się sterylnych wymazówek z końcówkami bawełnianymi lub wymazówek z alginianu wapnia, które można wprowadzić przez obie nozdrze w celu pobrania próbek z nosogardła². W przypadku błonicy skórnej próbki pobiera się z brzegów owrzodzeń lub ran, przy czym często konieczne jest ostrożne odsłonięcie powierzchni zmiany spod pseudobłony².

Bardzo ważne jest pobranie materiału przed rozpoczęciem antybiotykoterapii, jeśli jest to możliwe⁵. Próbki należy pobrać również od wszystkich osób, które miały bliski kontakt z pacjentem podejrzanym o błonicę⁶.

Specjalne podłoża hodowlane

Corynebacterium diphtheriae jest bakterią wymagającą, której wzrost wymaga zastosowania specjalnych, wzbogaconych podłoży hodowlanych. Do izolacji pierwotnej używa się różnych typów podłoży: podłoże Loefflera, podłoże Mueller-Miller z tellurkiem oraz podłoże Tinsdale z tellurkiem²⁷.

Podłoże Tinsdale z tellurkiem jest szczególnie przydatne, ponieważ umożliwia selektywny wzrost bakterii Corynebacterium, jednocześnie hamując wzrost innych mikroorganizmów. Charakterystyczne właściwości tych podłoży pozwalają na wstępną identyfikację organizmu na podstawie morfologii kolonii⁸.

Kluczowe znaczenie ma odpowiednie poinformowanie laboratorium o podejrzeniu błonicy, aby personel mógł zastosować właściwe podłoża selektywne¹⁹. Bez tej informacji bakterie mogą zostać pominięte lub błędnie zidentyfikowane jako inne bakterie z rodzaju Corynebacterium.

Identyfikacja mikroskopowa

Wstępna identyfikacja Corynebacterium diphtheriae może być przeprowadzona na podstawie badania mikroskopowego barwionego preparatu z materiału pobranego z błony. Barwienie metodą Grama ujawnia obecność Gram-dodatnich pałeczek z metachromatycznym (paciorkowatym) barwieniem w charakterystycznym układzie przypominającym chińskie znaki, z kolbowatymi zgrubieniami na jednym lub obu końcach⁴.

Te charakterystyczne cechy morfologiczne mogą wspierać rozpoznanie, jednak ostateczna identyfikacja wymaga hodowli i dalszych testów biochemicznych. Identyfikacja Gram-dodatnich pałeczek o charakterystycznym wyglądzie może być pomocna we wstępnej ocenie, ale nie jest wystarczająca do postawienia ostatecznej diagnozy⁸.

Proces hodowli i czas oczekiwania

Hodowla Corynebacterium diphtheriae wymaga odpowiednich warunków inkubacji i czasu. Próbki otrzymane w laboratorium są codziennie zakładane do hodowli (od poniedziałku do piątku) w celu identyfikacji bakterii tlenowych¹⁰. Czas oczekiwania na wyniki wynosi do 5 dni od otrzymania próbki przez laboratorium¹⁰.

Po wyizolowaniu podejrzanych kolonii przeprowadza się dalsze testy identyfikacyjne oraz molekularne badania w celu wykrycia genu toksyny błoniczej. Wykrywanie genu toksyny błoniczej metodą PCR u izolatów odbywa się co wtorek i czwartek, a czas oczekiwania wynosi 3 dni po potwierdzeniu identyfikacji izolatu¹¹.

Wyzwania diagnostyczne

Diagnostyka hodowlana błonicy napotyka na różne wyzwania praktyczne. Bakterie z rodzaju Corynebacterium są organizmami skóry i gardła, które rzadko powodują choroby, dlatego Corynebacterium diphtheriae lub Corynebacterium ulcerans mogą nie zostać zidentyfikowane z wymazu skórnego lub gardła, jeśli nie ma konkretnego wniosku o podejrzeniu błonicy przekazanego do laboratorium na formularzu zlecenia¹².

Dodatkowym wyzwaniem jest fakt, że identyfikacja samej bakterii Corynebacterium diphtheriae nie jest wystarczająca do potwierdzenia diagnozy. Wszystkie izolaty kliniczne zidentyfikowane jako Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans i Corynebacterium pseudotuberculosis muszą zostać przebadane w celu określenia, czy są toksyczne, niezależnie od źródła próbki¹⁰.

Współpraca z laboratoriami referencyjnymi

Ze względu na złożoność diagnostyki błonicy i rzadkość występowania tej choroby, wiele przypadków wymaga współpracy z laboratoriami referencyjnymi. Izolaty dodatnie pod względem genów toksyny błoniczej metodą PCR są przesyłane do Narodowego Laboratorium Mikrobiologii w celu potwierdzenia metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz fenotypowego wykrywania wyrażonej toksyny błoniczej za pomocą zmodyfikowanego testu Elka¹¹.

Potwierdzenie produkcji toksyny błoniczej (za pomocą zmodyfikowanego testu Elka) przeprowadza się w Narodowym Laboratorium Mikrobiologii w Winnipeg, Manitoba, a czas oczekiwania wynosi 9 dni kalendarzowych od daty otrzymania izolatu przez NML¹¹. Ta współpraca jest niezbędna do ostatecznego potwierdzenia diagnozy i podjęcia odpowiednich działań zdrowia publicznego.