Metody molekularne w diagnostyce toksoplazmozy – PCR i techniki DNA

Rozwój technik molekularnych znacząco poprawił możliwości diagnostyczne w toksoplazmozie, szczególnie w sytuacjach gdy klasyczne metody serologiczne okazują się niewystarczające¹. Metody molekularne oparte na amplifikacji specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych pasożyta oferują bezpośrednie wykrycie obecności Toxoplasma gondii w próbkach klinicznych.

Podstawy diagnostyki molekularnej w toksoplazmozie

Wykrywanie zakażenia T. gondii metodami molekularnymi jest atrakcyjne ze względu na ich wysoką czułość i specyficzność². Techniki molekularne mogą wykryć nawet niewielkie ilości materiału genetycznego pasożyta – reakcja łańcuchowa polimerazy pozwala na wykrycie zaledwie 10 lub mniej pasożytów w objętości reakcji³.

Pierwsza metoda PCR do wykrywania T. gondii, ukierunkowana na gen B1, została opracowana w 1989 roku⁴. Ta metoda była szeroko stosowana w diagnostyce prenatalnej wrodzonej toksoplazmozy oraz zakażeń T. gondii u pacjentów immunosupresyjnych. Od tego czasu techniki molekularne przeszły znaczną ewolucję, oferując coraz lepsze parametry diagnostyczne.

Diagnostyka molekularna może być wykonywana na każdym odpowiednim płynie ustrojowym lub tkance⁵. Reakcja łańcuchowa polimerazy została wykorzystana jako test uzupełniający do serodiagnostyki i może być wykonywana na różnych materiałach biologicznych. Obecność tachyzoitów obserwowanych w barwieniu metodą Giemsy z dowolnego płynu ustrojowego lub preparatów dotykowych z dowolnej tkanki może być interpretowana jako laboratoryjne potwierdzenie toksoplazmozy.

Techniki PCR i ich zastosowanie kliniczne

Molekularne metody diagnostyczne obejmują techniki takie jak konwencjonalna reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), zagnieżdżona PCR i real-time PCR do wykrywania DNA T. gondii w próbkach klinicznych⁶. Według ostatnich badań element powtarzalny o długości 529 pz wykazał czułość 10-krotnie wyższą niż czułość przy użyciu genu B1.

Real-time PCR wykrywanie DNA T. gondii oparte na elemencie powtarzalnym 529 pz jest najczęściej stosowanym molekularnym podejściem diagnostycznym w toksoplazmozie⁶. Granica wykrywalności zagnieżdżonej PCR elementu powtarzalnego 529 pz wynosi 640 fg DNA pasożyta, podczas gdy wskaźnik dla zagnieżdżonej PCR B1 wynosi 5,12 pg².

Real-time PCR może wykryć niskie stężenia docelowego DNA i określić ilościowo początkowe kopie specyficznego szablonu DNA⁷. Test real-time PCR z genem B1 jest uważany za najlepszą technikę diagnostyczną wrodzonej toksoplazmozy w porównaniu z konwencjonalną PCR i zagnieżdżoną PCR. Test molekularny może być również używany do wykrywania i pomiaru DNA T. gondii w próbce krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego lub płynu owodniowego⁸.

Materiały biologiczne do badań molekularnych

Badania PCR mogą być wykonywane na płynach ustrojowych, w tym płynie mózgowo-rdzeniowym, płynie owodniowym, płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i krwi⁹. Wybór odpowiedniego materiału biologicznego zależy od lokalizacji podejrzewanego zakażenia oraz dostępności próbki.

W przypadku podejrzenia zajęcia ośrodkowego układu nerwowego, badanie PCR płynu mózgowo-rdzeniowego charakteryzuje się wysoką specyficznością (96-100%) ale niską czułością (50%)¹⁰. PCR płynu mózgowo-rdzeniowego dla T. gondii ma wysoką specyficzność i niską czułość. Dla diagnostyki prenatalnej szczególnie przydatne jest badanie PCR płynu owodniowego, które wykazuje czułość i specyficzność odpowiednio 92% i 100%¹¹.

Preferowanymi próbkami do badań PCR są ciecz wodnista i płyn mózgowo-rdzeniowy, które oferują wysoką czułość i specyficzność w wykrywaniu DNA T. gondii¹². Dodatni wynik wskazuje na obecność organizmu, ale może nie różnicować zakażeń ostrych od przewlekłych. W diagnostyce ocznej toksoplazmozy reakcja łańcuchowa polimerazy próbek cieczy wodnistej i ciała szklistego to narzędzie o wysokiej czułości i specyficzności¹³.

Ograniczenia i interpretacja wyników PCR

Pomimo wysokiej specyficzności metod molekularnych, interpretacja wyników wymaga ostrożności. Ujemny wynik PCR nie wyklucza aktywnego zakażenia¹⁴. Jeśli test molekularny jest dodatni dla DNA T. gondii, oznacza to, że badana osoba ma aktywną infekcję toksoplazmozy. Ujemny wynik testu oznacza, że jest mniej prawdopodobne, że osoba ma toksoplazmozę, ale nie wyklucza zakażenia – Toxoplasma może nie być obecna w wystarczającej liczbie w próbce krwi lub płynu do wykrycia¹⁵.

W przypadku dodatniego wyniku PCR, Toxoplasma jest prawdopodobną przyczyną objawów klinicznych przy odpowiedniej historii klinicznej, wynikach hematologicznych, biochemicznych i/lub cytologicznych¹⁶. Wyniki testów PCR mogą również być pomocne u pacjentów immunosupresyjnych w pomocy w diagnostyce, obok serologii i prezentacji klinicznej¹⁷.

Nowoczesne techniki molekularne

Oprócz klasycznej PCR rozwijane są nowe techniki molekularne oferujące dodatkowe możliwości diagnostyczne. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) to technika amplifikacji DNA w warunkach izotermicznych, która łączy szybkość, wydajność i wysoką specyficzność¹⁸. Real-time PCR wykorzystująca sondy fluorescencyjne mierzy produkt amplifikacji w każdym cyklu i może być kwantyfikowana za pomocą standardów o znanym stężeniu.

PCR-RFLP opiera się na zdolności endonukleaz restrykcyjnych rozpoznających polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP)¹⁸. Niedawny rozwój metody Mn-PCR-RFLP umożliwia genetyczną charakterystykę lub klasyfikację T. gondii z próbek biologicznych z wysoką rozdzielczością⁷. Metody serotypowania oparte na polimorficznych polipeptydach mają potencjał, aby stać się wyborem do typowania T. gondii u ludzi i zwierząt.

Zastosowanie w różnych grupach pacjentów

Metody molekularne znajdują szczególne zastosowanie w specyficznych grupach pacjentów. U pacjentów immunosupresyjnych, gdzie testy serologiczne mogą być niewiarygodne, diagnostyka molekularna może dostarczyć cennych informacji diagnostycznych. Większość diagnoz jest stawiana albo domniemanie, albo na podstawie dodatniego wyniku PCR płynu mózgowo-rdzeniowego dla toksoplazmozy¹⁹.

W diagnostyce prenatalnej molekularne techniki wykrywania materiału genetycznego pasożyta w płynie owodniowym mogą być przydatne w przypadkach możliwego przeniesienia z matki na dziecko (zakażenie wrodzone)²⁰. Diagnostyka wrodzonego zakażenia może być dokonana przez wykrycie DNA T. gondii w płynie owodniowym przy użyciu metod molekularnych takich jak PCR²¹.

W przypadku noworodków badania PCR różnych płynów ustrojowych lub tkanek (łożysko) mogą być również wykonywane w celu potwierdzenia zakażenia²². Potwierdzenie wrodzonego zakażenia odbywa się poprzez analizę PCR płynu owodniowego (dla zakażenia płodowego) lub płynów ustrojowych (włączając płyn mózgowo-rdzeniowy) lub tkanek dla zakażenia noworodkowego.

Przyszłość diagnostyki molekularnej

Diagnostyka toksoplazmozy została zrewolucjonizowana przez pojawienie się diagnostyki molekularnej²³. Techniki molekularne odgrywają obecnie kluczową rolę w diagnostyce toksoplazmozy, szczególnie u pacjentów immunosupresyjnych lub w przypadku wrodzonej toksoplazmozy. Istnieje pilna potrzeba standaryzacji w celu zwiększenia porównywalności wyników między laboratoriami i badaniami klinicznymi.

Rozwój szybkich testów molekularnych typu point-of-care może w przyszłości znacznie uprościć diagnostykę toksoplazmozy. Nowe podejścia diagnostyczne, takie jak testy immunochromatograficzne, mogą dostarczać szybkich wyników podobnie do testów wykorzystywanych w diagnostyce COVID-19²⁴. Test Toxoplasma ICT IgG-IgM point-of-care dostarcza szybkich wyników na papierze immunochromatograficznym.

Metody molekularne stanowią istotne uzupełnienie tradycyjnych metod diagnostycznych w toksoplazmozie, oferując wysoką czułość i specyficzność szczególnie w trudnych przypadkach diagnostycznych. Ich zastosowanie jest szczególnie cenne u pacjentów immunosupresyjnych, w diagnostyce prenatalnej oraz w przypadkach zajęcia ośrodkowego układu nerwowego, gdzie klasyczne metody serologiczne mogą okazać się niewystarczające.