Diagnostyka cyklosporozy – metody rozpoznawania zakażenia Cyclospora

Diagnostyka cyklosporozy stanowi znaczące wyzwanie dla laboratoriów medycznych ze względu na specyficzne właściwości pasożyta Cyclospora cayetanensis. Rozpoznanie tej choroby wymaga zastosowania specjalistycznych metod laboratoryjnych, które nie są rutynowo wykonywane w większości placówek diagnostycznych¹². Lekarze muszą szczególnie wnioskować o przeprowadzenie badań w kierunku cyklosporozy, co często jest pomijane w standardowych badaniach parazytologicznych kału.

Podstawowe metody diagnostyczne

Główną metodą rozpoznawania cyklosporozy jest badanie próbek kału pod kątem obecności oocyst pasożyta¹⁴. Proces diagnostyczny może być utrudniony, ponieważ nawet pacjenci z objawami mogą wydalać zbyt małą liczbę oocyst, aby mogły być łatwo wykryte podczas standardowych badań laboratoryjnych¹. Z tego powodu pacjenci często muszą dostarczyć kilka próbek kału pobranych w różnych dniach⁴⁵.

Laboratoria powinny stosować czułe metody odzyskiwania oocyst, takie jak techniki koncentracji oraz metody wykrywania, które uwydatniają oocysty Cyclospora⁵. Szczególnie przydatna jest technika koncentracji formalina-octan etylu z wirówkowaniem przez 10 minut przy 500 x g, po której następuje badanie mokrego preparatu i/lub barwionej płytki osadu⁵.

Specjalistyczne techniki mikroskopowe

Mikroskopia fluorescencyjna z promieniowaniem ultrafioletowym stanowi czułą technikę do szybkiego badania osadów kału pod kątem oocyst Cyclospora⁵. Oocysty wyróżniają się dzięki swojej zdolności do autofluorescencji, co oznacza, że świecą własnym światłem pod wpływem promieniowania UV⁶. Przy użyciu filtra wzbudzającego UV ustawionego na 330-365 nm lub 450-490 nm, oocysty są łatwo widoczne⁵.

Jeśli zostaną znalezione podejrzane oocysty Cyclospora, można następnie użyć mikroskopii w świetle jasnym, kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego, aby potwierdzić, że struktury mają charakterystyczne cechy morfologiczne oocyst Cyclospora⁷. Na płytce barwionej zmodyfikowaną metodą kwasooporna, oocysty Cyclospora wykazują zwykle zmienną kwasooporność⁷.

Metody barwienia

Stosowanie specjalistycznych technik barwienia znacząco poprawia wykrywalność Cyclospora cayetanensis⁸. Zmodyfikowane barwienie kwasoooporne oraz zmodyfikowane barwienie safraninowe są najczęściej wykorzystywane w diagnostyce⁴⁹. Przy użyciu „gorącej” zmodyfikowanej techniki safraninowej, oocysty Cyclospora barwią się jednolicie na jaskrawy czerwono-pomarańczowy kolor⁷.

Tradycyjne metody barwienia, takie jak mokry preparat i barwienie trichromem używane rutynowo w badaniach parazytologicznych, są niewystarczające do wykrywania Cyclospora cayetanensis³. Pasożyt słabo barwi się tymi metodami, co może prowadzić do przeoczenia diagnozy.

Diagnostyka molekularna

Metody diagnostyki molekularnej, takie jak analiza łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), są wykorzystywane do poszukiwania DNA pasożyta w kale⁵⁶. Diagnostyka molekularna C. cayetanensis odbywa się głównie za pomocą testów multipleksowych dla różnych patogenów jelitowych⁴. Panel jelitowy BioFire FilmArray ma zarówno certyfikat FDA do diagnostyki in vitro w Stanach Zjednoczonych, jak i oznaczenie CE¹¹.

Należy jednak pamiętać, że nie wszystkie komercyjnie dostępne panele molekularne wykrywają C. cayetanensis⁸. Lekarze powinni skonsultować się ze swoim głównym laboratorium klinicznym, aby określić, który test molekularny jest wykorzystywany i czy można wykryć C. cayetanensis⁸ Zobacz więcej: Nowoczesne metody molekularne w diagnostyce cyklosporozy.

Wyzwania diagnostyczne

Oocysty Cyclospora są łatwo pomijane podczas rutynowych badań, a ich wydalanie na niskim poziomie (około 1-2 logarytmy niższym niż w przypadku gatunków Cryptosporidium) jest powszechne⁵. Diagnostyka może być trudna również dlatego, że nawet objawowi pacjenci mogą nie wydalać wystarczającej liczby oocyst w kale, aby mogły być łatwo wykryte podczas badań laboratoryjnych¹².

Zaleca się pobranie co najmniej trzech próbek kału (każda pobrana w odstępie 24 godzin) w celu osiągnięcia najwyższej czułości diagnostycznej⁸¹³. Pojedyncza negatywna próbka kału nie wyklucza rozpoznania; optymalne są trzy próbki¹³.

Alternatywne metody diagnostyczne

W niektórych przypadkach, gdy badanie kału nie ujawnia przyczyny przewlekłej biegunki, lekarze mogą użyć elastycznego narzędzia do oglądania (endoskopu) w celu zbadania górnej części przewodu pokarmowego i pobrania próbki tkanki (biopsji) do zbadania pod mikroskopem i analizy DNA pasożyta¹⁴. Czasami diagnoza jest stawiana dopiero wtedy, gdy wewnątrzkomórkowe stadia pasożyta zostają wykryte w biopsji tkanki jelitowej⁴.

Cytometria przepływowa może być użyteczną alternatywą dla mikroskopii w przesiewaniu dużej liczby próbek kału pod kątem oocyst Cyclospora, szczególnie w sytuacji epidemii¹⁵. Chociaż czas przygotowania próbki do cytometrii przepływowej może być podobny lub nawet dłuższy niż w przypadku mikroskopii, czas potrzebny na analizę próbki metodą cytometrii przepływowej jest znacznie krótszy¹⁵ Zobacz więcej: Wyzwania i ograniczenia w diagnostyce cyklosporozy.

Znaczenie wczesnej diagnostyki

Wczesne wykrycie i leczenie może prowadzić do korzystnego wyniku klinicznego¹⁶. Diagnostyka kliniczna opiera się na głównych objawach klinicznych i konwencjonalnych metodach laboratoryjnych, które zwykle obejmują badanie mikroskopowe mokrych rozmazów, testy barwienia, mikroskopię fluorescencyjną, badania serologiczne lub badania DNA w poszukiwaniu oocyst w kale¹⁶.

Szybkie zgłaszanie do służb zdrowia publicznego jest niezbędne do zapobiegania dodatkowym przypadkom cyklosporozy¹³. Dostawcy opieki zdrowotnej i laboratoria są zobowiązani do zgłaszania potwierdzonych przypadków cyklosporozy do odpowiedniego lokalnego departamentu zdrowia w ciągu jednego tygodnia¹³.