Testy serologiczne w diagnostyce brucelozy – wykrywanie przeciwciał

Testy serologiczne stanowią najczęściej stosowaną metodę diagnostyki brucelozy w praktyce klinicznej¹. Diagnostyka pośrednia opiera się na testach serologicznych wykrywających przeciwciała w surowicy pacjentów². Pomimo swoich niedoskonałości, testy serologiczne pozostają główną metodą diagnostyczną brucelozy w krajach endemicznych i o niskich i średnich dochodach, ponieważ są tanie, łatwe w użyciu i mają wysoką ujemną wartość predykcyjną².

Większość komercyjnych laboratoriów klinicznych wykonuje testy serologiczne, które mogą wykryć przeciwciała przeciwko trzem gatunkom Brucella: B. abortus, B. melitensis i B. suis³⁴. Metody serologiczne wykorzystują głównie łańcuchy gładkie LPS (lipopolisacharydy), które wywołują największe reakcje immunologiczne u różnych żywicieli⁵.

Podstawowe zasady testów serologicznych

Serologiczna diagnostyka brucelozy powszechnie opiera się na potwierdzeniu rosnących mian przeciwciał specyficznych dla Brucella⁶. Jest to pośredni dowód zakażenia⁶. Testy serologiczne są używane zarówno do pierwotnej diagnostyki zakażenia, jak i do monitorowania leczenia⁶.

Niektóre testy serologiczne wymagają dwóch próbek surowicy do potwierdzenia brucelozy: pierwsza powinna być pobrana w ciągu 7 dni od początku objawów, a druga 2-4 tygodnie później w celu porównania poziomów przeciwciał⁴⁷. Czterokrotny wzrost od pierwszej próbki do drugiej jest uważany za diagnostyczny⁸. Jeśli pobranie dwóch próbek surowicy nie jest możliwe, można postawić prawdopodobne rozpoznanie na podstawie pojedynczej próbki⁷.

Test Rose Bengal – podstawowy test przesiewowy

Test Rose Bengal jest najszerzej stosowanym testem przesiewowym dla brucelozy⁹. Może być używany jako test aglutynacji punktowej przy użyciu barwionego antygenu⁹. Test Rose Bengal wykazuje bardzo wysoką skuteczność diagnostyczną, co może wynikać z doboru próby, z pacjentami rekrutowanymi podczas wczesnych stadiów choroby, zazwyczaj w ciągu trzech miesięcy od początku objawów¹⁰.

W badaniach porównawczych test Rose Bengal, ELISA IgG/IgM i PCR wykazały równie wysokie wyniki, wskazując na doskonałą ogólną dokładność diagnostyczną¹¹. Gdy wykonywany na czystej surowicy, czułość testu Rose Bengal wynosiła 97,3%, podczas gdy dodatnia wartość predykcyjna wynosiła tylko 42,6%¹². Przy zastosowaniu granicznego miana obserwowano lepszą skuteczność: 85,1% dla czułości, 99,3% dla specyficzności, 84,0% dla dodatniej wartości predykcyjnej i 99,4% dla ujemnej wartości predykcyjnej¹².

Standardowy test aglutynacji (SAT)

Test aglutynacji w probówkach, opracowany przez Bruce’a, mierzy przeciwciała przeciwko gładkiemu lipopolisacharydowi (LPS); pozostaje najpopularniejszym narzędziem testowym do diagnostyki brucelozy¹. Standardowy test aglutynacji w probówkach (SAT) opracowany przez Wrighta i współpracowników pozostaje najpopularniejszym i łatwym do wykonania testem¹⁴.

Miana wyższe niż 1:160 w połączeniu z odpowiednim obrazem klinicznym są uważane za wysoce sugestywne zakażenia¹. Miano aglutynacji większe niż 1:160 jest uważane za znaczące w obszarach nieendemicznych, a większe niż 1:320 w obszarach endemicznych¹⁵. W przypadku braku próbki z ostrej fazy, miano co najmniej 1:160 w próbce surowicy z fazy rekonwalescencji jest diagnostyczne⁹.

Główne ograniczenia testów aglutynacji obejmują potencjalną reaktywność krzyżową z IgM innych organizmów, takich jak Francisella tularensis, Salmonella urbana, Yersinia enterocolitica serotyp O9, Vibrio cholerae, Afipia clevelandensis i niektóre inne bakterie¹.

Test ELISA – nowoczesna diagnostyka serologiczna

Test immunoenzymatyczny (ELISA) zazwyczaj wykorzystuje białka cytoplazmatyczne jako antygeny i mierzy IgM, IgG i IgA, umożliwiając lepszą interpretację, szczególnie w przypadkach nawrotu brucelozy¹⁶. ELISA stał się coraz bardziej popularny, a także standaryzowanym testem dla brucelozy¹⁴. ELISA to kolejny test serologiczny, który jest czuły, szybki i wygodny do wykrywania brucelozy¹⁷.

ELISA wykazuje wysoką czułość i specyficzność i powinien być używany jako rutynowy test laboratoryjny, gdy podejrzewa się brucelozę w praktyce klinicznej¹⁷. Test ELISA był najbardziej czułym testem (97%), wykazującym większą specyficzność (96%) i dobre dodatnie i ujemne wartości predykcyjne (odpowiednio 98% i 94%)¹⁸. ELISA był jedynym dodatnim testem u 6% pacjentów, u których bruceloza została potwierdzona hodowlą¹⁸.

Dodatkowe testy serologiczne

Test Coombsa (test antyglobuliny ludzkiej) jest używany do wykrywania przeciwciał niepełnych, które mogą nie być wykryte w standardowych testach aglutynacji¹⁵. Komercyjny test Brucellacapt, jednoetapowy test immunozachwytu do wykrywania całkowitych przeciwciał przeciw Brucella, jest coraz częściej stosowanym testem uzupełniającym, gdy zasoby na to pozwalają¹⁹.

Test polaryzacji fluorescencyjnej (FPA) oferuje cenną alternatywę dla konwencjonalnych testów serologicznych¹⁴. Test polaryzacji fluorescencyjnej wydaje się być cenną metodą diagnostyki brucelozy u ludzi²⁰. Testy dipstick są nowe i obiecujące, oparte na wiązaniu przeciwciał IgM Brucella, i są proste, dokładne i szybkie¹⁹.

Ograniczenia testów serologicznych

Główne ograniczenia testów serologicznych obejmują brak wspólnych kryteriów interpretacyjnych, nieoptymalną specyficzność z powodu krzyżowej reaktywności międzygatunkowej oraz niską czułość we wczesnym stadium choroby²¹. Testy serologiczne, chociaż brakuje im specyficzności i dostarczają wyników, które mogą być trudne do interpretacji u osób wielokrotnie narażonych na bakterie Brucella, pozostają jednak kamieniem węgielnym diagnostycznym w krajach o ograniczonych zasobach²².

Obecność specyficznych IgM jest uważana za sugestywną ostrego lub niedawnego zakażenia⁶. Jednak wczesna odpowiedź IgM może nie być widoczna u pacjentów zakażonych szczepami o powolnym początku, a także u tych, którzy pojawili się późno w przebiegu choroby, lub u tych z nawrotami⁶. Ponadto, znaczące miana przeciwciał mogą utrzymywać się przez kilka miesięcy, a nawet lata u pacjentów z historią brucelozy²³.

Kombinowanie testów serologicznych

Połączenie testu Rose Bengal z SAT lub Brucellacapt znacząco poprawiło skuteczność diagnostyczną, zmniejszając liczbę wyników fałszywie dodatnich²⁵. Najbardziej obiecujące wyniki zaobserwowano, gdy zbudowano algorytm łączący Rose Bengal, Brucellacapt i ELISA dla IgM i IgG (wartość punktowa 0,5 z 90,5% dla czułości, 99,7% dla specyficzności, 92,4% dla dodatniej wartości predykcyjnej i 99,6% dla ujemnej wartości predykcyjnej)²⁵.

Łącząc dwa główne testy serologiczne, wyniki Rose Bengal i SAT, w celu określenia najlepszego algorytmu diagnostycznego do diagnostyki brucelozy, przy użyciu progu 0,5, średnie wyniki w 10-krotnej walidacji krzyżowej wynosiły 84% dla czułości, 99% dla specyficzności i AUC = 0,99¹². Integrując wiele metod testowych i łącząc mocne strony każdej z nich, takie jak czułość jednego testu i specyficzność drugiego, można osiągnąć większą ogólną dokładność w diagnostyce²⁶.

Monitorowanie leczenia

Miano przeciwciał powinno spadać po skutecznym leczeniu⁶. W przeciwnym razie pacjent powinien być zbadany pod kątem możliwości przewlekłej choroby ogniskowej lub nawrotu⁶. Testy serologiczne nie są przydatne w monitorowaniu skuteczności leczenia, ponieważ miana przeciwciał Brucella spadają powoli po leczeniu²⁴. Dlatego serologia kontrolna wymaga starannej interpretacji²⁴.

Jeśli istnieje silne podejrzenie kliniczne brucelozy, dobrą praktyką jest powtórzenie testu po okresie 6 tygodni¹³. Testy przesiewowe używane w jednostkach referencyjnych są bardzo czułe (niski odsetek wyników fałszywie ujemnych), jednak jeśli istnieje silne podejrzenie kliniczne brucelozy, dobrą praktyką jest powtórzenie testu po okresie 6 tygodni¹³.