Badania molekularne w diagnostyce mięsaka maziówkowego – FISH, RT-PCR

Badania molekularne stanowią fundamentalny element współczesnej diagnostyki mięsaka maziówkowego, umożliwiając precyzyjne rozpoznanie tego rzadkiego nowotworu na podstawie charakterystycznych zmian genetycznych. Rozwój technik molekularnych zrewolucjonizował diagnozowanie mięsaka maziówkowego, czyniąc je bardziej dokładnym i niezawodnym.

Podstawy molekularne mięsaka maziówkowego

Mięsak maziówkowy jest definiowany przez translokację między chromosomem X i 18, która prowadzi do ekspresji białek fuzyjnych SS18:SSX¹. Obecność t(X;18)(p11.2;q11.2) jest cechą patognomoniczną mięsaka maziówkowego¹. Mięsak maziówkowy charakteryzuje się patognomoniczną translokacją t(X:18), która jest obecna w 95% przypadków².

Większość, a być może wszystkie przypadki mięsaka maziówkowego są związane z wzajemną translokacją t(x;18)(p11.2;q11.2)³. Analiza cytogenetyczna pomaga lekarzowi w wykryciu specyficznej translokacji chromosomowej między chromosomem 18 i chromosomem X – a mianowicie t(X;18)(p11;q11)⁴. Translokacja ta powoduje powstanie genu fuzyjnego SYT-SSX1, SYT-SSX2 lub SYT-SSX4⁴.

Cytogenetycznie 90% mięsaków maziówkowych jest związanych z translokacją chromosomową t(X;18)(p11.2;q11.2), występującą zarówno w formach dwufazowych, jak i jednofazowych⁵. Translokacja skutkuje powstaniem dwóch genów fuzyjnych: SYT-SSX1 i SYT-SSX2⁵.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR)

RT-PCR jest uznawana za najbardziej precyzyjną metodę wykrywania charakterystycznych zmian genetycznych w mięsaku maziówkowym. Identyfikacja anomalii genetycznej uzyskiwana jest za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) w tkance guza (i ewentualnie we krwi), z czułością 96% i specyficznością 100%⁴. Transkrypty fuzyjne można wykryć za pomocą molekularnych technik diagnostycznych w próbkach biopsyjnych⁴.

Zarówno hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH), jak i reakcja łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) zostały zwalidowane w diagnozie tej translokacji²⁶. Ponad 95% mięsaków maziówkowych można scharakteryzować przez ekspresję genu SYT-SSX i jest on używany jako rutynowy marker diagnostyczny dla tego typu nowotworu⁷.

Test genetyczny nazywany cytogenetyką może potwierdzić rearanżację chromosomu X i chromosomu 18, która jest obecna w większości przypadków mięsaka maziówkowego⁸. Wykrycie krążącego produktu genu fuzyjnego SYT-SSX może być kolejną ważną metodą oceny ryzyka przerzutowego u pacjentów z mięsakiem maziówkowym⁷.

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH)

FISH stanowi alternatywną metodę wykrywania charakterystycznych zmian genetycznych w mięsaku maziówkowym. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) jest tańsza niż RT-PCR⁴. Została zasugerowana jako dobra metoda pierwszego wyboru dla mięsaka maziówkowego⁴. Metoda ta ma niższą czułość niż RT-PCR, ale wyniki obu metod są zgodne w 76% przypadków⁴.

Test FISH dla mięsaka maziówkowego wykrywa rearanżacje chromosomowe, które obejmują gen SS18 (SYT) na chromosomie 18q11.2⁹. Wyniki tego testu mogą pomóc w diagnozie mięsaka maziówkowego⁹. Większość pacjentów z mięsakiem maziówkowym ma rearanżacje genu SS18, które skutkują t(X;18)(p11;q11) z fuzją SS18/SSX1⁹.

Potwierdzenie obecności masy przez radiografię i MRI jest zwykle wykonywane przed biopsją. Definitywna diagnoza mięsaka maziówkowego opiera się na biopsji. Biopsyjna tkanka jest często testowana pod kątem translokacji t(X;18)(p11;q11) za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH), dla której około 90% mięsaków maziówkowych jest dodatnich¹⁰.

Znaczenie kliniczne testów molekularnych

Wykrycie rearanżacji genu SS18 jest uważane za potężne narzędzie w ustalaniu diagnozy mięsaków maziówkowych¹¹. Biopsje i testowanie pod kątem rearanżacji genów są zalecane dla wszystkich pacjentów, u których nie można wykluczyć mięsaka maziówkowego¹¹. Dlatego zalecamy, aby lekarze ortopedzi wykonywali biopsje i testowanie pod kątem rearanżacji genu SS18 u wszystkich pacjentów, u których nie można wykluczyć mięsaka maziówkowego, szczególnie tych zlokalizowanych w kończynach i stawach, aby zminimalizować błędne diagnozy¹².

Molekularny test na mięsak maziówkowy może nie być rutynowo wymagany do diagnozy przypadków mięsaka maziówkowego powstających w zwykłych lokalizacjach lub mających typową histologię i profile immunohistochemiczne¹³. Z drugiej strony okazuje się bardzo pomocny w diagnozie rzadkich przypadków mięsaka maziówkowego powstających w nietypowych lokalizacjach, mających nietypową histologię i niekonwencjonalne profile immunohistochemiczne, które mogą być problematyczne w odróżnieniu od innych naśladowców histologicznych¹³.

Badania immunohistochemiczne jako uzupełnienie

Oprócz testów molekularnych, w diagnostyce mięsaka maziówkowego wykorzystuje się również badania immunohistochemiczne. Immunohistochemia (IHC): przeciwciało specyficzne dla fuzji SS18 i przeciwciało SSX-CT są wysoce czułe i specyficzne dla mięsaka maziówkowego i gdy są używane razem, mogą wyeliminować potrzebę testowania molekularnego w większości przypadków³.

Przeciwciało SS18-fusion jest 95% czułe i specyficzne dla mięsaka maziówkowego¹⁴. Do ustalenia prawidłowej diagnozy badanie immunohistochemiczne na keratynę i EMA jest bardzo pomocne. Prawie 90% wariantów monofazowych jest przynajmniej ogniskowo dodatnich na keratynę lub EMA¹⁴.

Przypadki wymagające testów molekularnych

Testy molekularne są szczególnie wartościowe w określonych sytuacjach klinicznych. Wykryliśmy, że wykrywanie transkryptów fuzyjnych SS18/SSX za pomocą RT-PCR jest cenną metodą potwierdzania diagnozy mięsaka maziówkowego, szczególnie w trudnych przypadkach powstających w nietypowych miejscach lub prezentujących się z nietypową histologią i niekonwencjonalnymi profilami immunohistochemicznymi¹⁵.

Analiza molekularna dla wykrywania transkryptów fuzyjnych SS18/SSX okazała się bardzo użytecznym narzędziem do ustalania diagnozy mięsaka maziówkowego w trudnych przypadkach¹⁵. Nasz test molekularny na mięsak maziówkowy ułatwił również diagnozę innych 5 przypadków z niejednoznaczną diagnozą histologiczną i wynikami immunohistochemii przez wykluczenie mięsaka maziówkowego z jego histologicznych naśladowców¹⁵.

W nieobecności typowej histomorfologii wykrywanie genów fuzyjnych onkogenów jest niezwykle pomocne w różnicowaniu mięsaka maziówkowego od innych guzów¹⁶. Identyfikacja tego genu fuzyjnego pozostaje złotym standardem diagnozy w obecności zgodnej histologii i immunofenotypu¹⁶.

Ograniczenia i wyzwania testów molekularnych

Pomimo wysokiej skuteczności, testy molekularne mają pewne ograniczenia. Oprócz molekularnych testów diagnostycznych, żadne badania laboratoryjne nie są specyficzne dla tej diagnozy⁴. W niektórych przypadkach może wystąpić brak charakterystycznej translokacji, co wymaga ostrożnej interpretacji wyników w kontekście klinicznym i histopatologicznym.

Chociaż histopatologia i profil immunohistochemiczny są klasyczne dla dwufazowego mięsaka maziówkowego, brakuje klasycznej translokacji SS18, która jest obserwowana w większości mięsaków maziówkowych¹⁷. Kluczem do prawidłowej diagnozy jest zatem wysoki wskaźnik podejrzeń¹⁷. Immunohistochemia dla TLE-1 i FISH lub PCR dla wykrywania SS18 to dwa potężne narzędzia do potwierdzenia diagnozy¹⁷.

Przyszłość diagnostyki molekularnej

Patologowie coraz częściej stosują testowanie molekularne jako pomoc w diagnozie mięsaka¹⁸. Testowanie molekularne (tj. testowanie DNA i/lub RNA) stało się coraz bardziej powszechne w diagnostycznych ścieżkach testowania mięsaków i jest często wymagane w protokołach badań klinicznych¹⁸.

Autorzy konkludują, że dla wszystkich mięsaków z nawracającymi aberracjami genetycznymi (np. mięsak maziówkowy, mięsak prążkowanokomórkowy pęcherzykowy) powinno być wykonywane testowanie molekularne¹⁸. Obecne wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) i National Comprehensive Cancer Center (NCCN) uznają użyteczność testowania molekularnego w diagnozie mięsaka¹⁸.

Obecne wytyczne NCCN dla mięsaków tkanek miękkich potwierdzają diagnostyczną użyteczność molekularnego testowania genetycznego i zalecają, aby takie testowanie było przeprowadzane przez patologa z doświadczeniem w diagnozie mięsaka i molekularnych technikach diagnostycznych¹⁸. Podczas gdy morfologia i immunohistochemia pozostają fundamentem diagnozy mięsaka, metody molekularne wykazały potencjał poprawy i/lub udoskonalenia diagnozy tych rzadkich guzów¹⁸.

Praktyczne aspekty wykonywania testów

W praktyce klinicznej wykonywanie testów molekularnych wymaga odpowiedniego przygotowania materiału i doświadczenia laboratorium. Test został opracowany, a jego charakterystyki wydajności analitycznej zostały określone przez Quest Diagnostics. Nie został oczyszczony ani zatwierdzony przez FDA⁹. Ten test został zwalidowany zgodnie z przepisami CLIA i jest używany do celów klinicznych⁹.

Mięsak maziówkowy to mięsak tkanek miękkich, który występuje głównie w kończynach. Diagnoza histologiczna i immunohistochemiczna może być trudna, ponieważ mięsak maziówkowy często przypomina inne mięsaki wrzecionowatokomórkowe⁹. Dlatego tak ważne jest zastosowanie testów molekularnych w przypadkach budzących wątpliwości diagnostyczne.

Rozwój diagnostyki molekularnej umożliwił nie tylko precyzyjniejsze rozpoznawanie mięsaka maziówkowego, ale także lepsze zrozumienie biologii tego nowotworu, co przekłada się na możliwości opracowania bardziej skutecznych terapii celowanych. Przyszłość diagnostyki molekularnej w mięsaku maziówkowym wiąże się z dalszym rozwojem technik sekwencjonowania nowej generacji oraz liquid biopsy, które mogą umożliwić nieinwazyjne monitorowanie przebiegu choroby.