Badania genetyczne w diagnostyce złośliwej hipertermii

Badania genetyczne stanowią coraz bardziej wartościową alternatywę dla inwazyjnego testu kurczliwości mięśni w diagnostyce złośliwej hipertermii. Testowanie molekularne wymaga jedynie próbki krwi, z której można wyekstrahować DNA i przeszukać je pod kątem mutacji genetycznych znanych z powodowania złośliwej hipertermii¹². Analiza DNA oferuje alternatywę dla testu kurczliwości in vitro, wymagając jedynie próbki krwi, którą można przesłać do akredytowanego laboratorium diagnostycznego³.

Wprowadzenie molekularnego testowania genetycznego dla złośliwej hipertermii nastąpiło w 2005 roku¹. Od tego czasu badania genetyczne stały się szeroko dostępne w kilku wyznaczonych ośrodkach⁴. Mimo ciągłych postępów, molekularne testowanie genetyczne ma ograniczoną czułość i jest używane raczej do potwierdzania podatności na złośliwą hipertermię niż do wykluczania pacjentów z diagnozy⁴.

Geny związane z podatnością na złośliwą hipertermię

Podatność na złośliwą hipertermię może być spowodowana mutacjami w co najmniej trzech genach: RYR1, CACNA1S i STAC3, przy czym mutacje w genie RYR1 są znacznie częstsze niż w pozostałych dwóch genach⁵. Podstawą genetyczną podatności na złośliwą hipertermię są w dużej mierze mutacje w genie RYR1, chociaż kilka badań linkage’u i przesiewowych wykazało, że mutacje związane z podatnością znaleziono tylko w RYR1 i rzadziej w CACNA1S – genie dla szkieletowego mięśniowego kanału wapniowego typu L⁶.

Gen RYR1 koduje receptor ryanodynowy typu 1, który jest kluczowy dla uwalniania wapnia z retikulum sarkoplazmatycznego w mięśniach szkieletowych. Mutacje w tym genie odpowiadają za większość przypadków podatności na złośliwą hipertermię⁷. Z kolei mutacje w genie CACNA1S powodują mniej niż 1% wszystkich przypadków podatności na złośliwą hipertermię⁷.

Obecnie zidentyfikowano ponad 400 wariantów związanych ze złośliwą hipertermią w obrębie genu RYR1⁸. Istnieje ponad 45 mutacji, które są uznawane za diagnostyczne dla złośliwej hipertermii⁹. Badania genetyczne mogą ujawnić mutacje w lokalizacjach RYR1, STAC3 i CACNA1S na DNA⁹. Europejska Grupa ds. Złośliwej Hipertermii ustanowiła kryteria, włączając badania funkcjonalne wariantów DNA, aby ustalić, czy wariant jest klinicznie istotny⁸.

Metodologia badań genetycznych

Współczesne badania genetyczne wykorzystują sekwencjonowanie nowej generacji (Next Generation Sequencing, NGS), które zapewnia potencjalnie opłacalne, szybkie i wysokowydajne platformy zarówno do odkrywania wariantów, jak i diagnozy na poziomie całego genomu⁸. Tradycyjne sekwencjonowanie DNA z genomowego DNA lub komplementarnego DNA przygotowanego z tkanki biopsji mięśniowej jest czasochłonne i pracochłonne, dlatego NGS stanowi znaczący postęp⁸.

Typowe panele genetyczne analizują geny CACNA1S i RYR1, przy czym jeden lub więcej eksonów może nie być pokrytych przez sekwencjonowanie dla wskazanego genu¹⁰. Testy charakteryzują się wysoką dokładnością analityczną – na podstawie wyników badań walidacyjnych osiągają 99% analityczną czułość i swoistość dla wariantów pojedynczego nukleotydu, insercji i delecji o długości do 15 par zasad oraz delecji i duplikacji na poziomie eksonu¹¹.

Badania genetyczne wykonuje się za pomocą sekwencjonowania nowej generacji z dodatkowym sekwencjonowaniem Sanger w razie potrzeby⁵. Metodologia obejmuje również analizę dużych rearranżacji genetycznych, chociaż niektóre warianty mogą nie zostać wykryte z powodu ograniczeń technicznych w obecności pseudogenów, regionów powtarzalnych lub homologicznych¹².

Wskazania do badań genetycznych

Testowanie molekularne podatności na złośliwą hipertermię jest zalecane dla określonych grup pacjentów. Przede wszystkim dotyczy to osób z potwierdzonym lub podejrzanym klinicznym epizodem złośliwej hipertermii lub pozytywnym testem kurczliwości¹². Badania są również rekomendowane dla krewnych osób z pozytywnym testem kurczliwości lub znanym wariantem predysponującym do złośliwej hipertermii¹².

Idealni kandydaci do testów genetycznych to osoby z wywiadem rodzinnym złośliwej hipertermii wraz z pozytywnym testem kurczliwości in vitro lub wyraźnym epizodem złośliwej hipertermii. Testowanie powinno rozpocząć się u takiego członka rodziny, a jeśli zostanie zidentyfikowana mutacja przyczynowa, inni członkowie rodziny mogą być przebadani przy znacznie obniżonym koszcie⁵.

Mniej idealni kandydaci to osoby z samym wywiadem rodzinnym złośliwej hipertermii lub z epizodem podobnym do złośliwej hipertermii bez wywiadu rodzinnego⁵. Badania genetyczne są również wykorzystywane do oceny podatności u zdrowych osób z wywiadem rodzinnym złośliwej hipertermii¹⁰¹³.

Ograniczenia i wyzwania badań genetycznych

Mimo postępów w technologii, badania genetyczne w diagnostyce złośliwej hipertermii napotykają na znaczące ograniczenia. Najważniejszym z nich jest fakt, że do połowy osób z podatnością na złośliwą hipertermię nie ma mutacji w znanych genach⁷. Test genetyczny charakteryzuje się niską czułością dla diagnostyki złośliwej hipertermii i w większości sytuacji nie może zastąpić testu CHCT¹.

Czułość badań genetycznych dla idealnych kandydatów (wywiad rodzinny złośliwej hipertermii plus pozytywny test kurczliwości in vitro lub epizod złośliwej hipertermii) wynosi około 60%⁵. Oznacza to, że znaczna część osób z potwierdzoną podatnością nie będzie miała wykrywalnych mutacji w obecnie znanych genach.

Dodatkowo, badania wykazały, że w 2,6% rodzin osoba może nosić rodzinną mutację RYR1, podczas gdy wynik testu kurczliwości będzie ujemny. Z drugiej strony, w 2,6% rodzin osoba może być sklasyfikowana jako normalna przez diagnostykę genetyczną, podczas gdy w rzeczywistości będzie podatna według testu kurczliwości¹⁴. Te rozbieżności podkreślają, że przesiewowe badanie DNA w kierunku podatności na złośliwą hipertermię nie jest możliwe w odizolowaniu od testu kurczliwości z powodu ryzyka, choć niewielkiego, fałszywie ujemnych diagnoz¹⁴.

Z powodu złożonej natury złośliwej hipertermii, ujemny wynik testu genetycznego nie może być używany do wykluczenia podatności pacjenta na złośliwą hipertermię. Pacjenci z ujemnymi wynikami genetycznymi powinni otrzymać ofertę testowania kurczliwości w celu potwierdzenia ich statusu niepodatności na złośliwą hipertermię¹⁵.

Strategie diagnostyczne i wytyczne

Europejska Grupa ds. Złośliwej Hipertermii opublikowała niedawno wytyczne dotyczące genetycznej diagnostyki podatności na złośliwą hipertermię¹⁶. Wytyczne te zostały opracowane w celu uzupełnienia procedury testowania biopsji mięśniowej – testu kurczliwości in vitro, który przez ostatnie 30 lat był jedyną metodą przesiewowego badania pacjentów i który pozostaje metodą ostatecznej diagnozy u podejrzanych probantów¹⁶.

Testowanie genetyczne przy użyciu określonych mutacji w genie RYR1 wykazanych jako przyczynowe dla złośliwej hipertermii poprzez badania biochemiczne in vitro lub poprzez analizę sprzężeń z markerami otaczającymi locus RYR1 jest obecnie możliwe¹⁶. Osoby noszące mutację przyczynową lub haplotyp wysokiego ryzyka są uważane za zagrożone rozwojem złośliwej hipertermii niezależnie od diagnoz testu kurczliwości¹⁶.

Akceptowaną praktyką Europejskiej Grupy ds. Złośliwej Hipertermii jest wykorzystanie testu kurczliwości do charakteryzowania osób, u których brakuje rodzinnej mutacji lub haplotypu wysokiego ryzyka, aby zminimalizować fałszywie ujemne wyniki poprzez diagnostykę genetyczną i formalnie wykluczyć ryzyko złośliwej hipertermii¹⁷. Test kurczliwości pozostaje również definitywną metodą diagnozy dla oceny podejrzanych probantów złośliwej hipertermii¹⁷.

Decyzja o przeprowadzeniu przesiewu DNA lub biopsji mięśniowej i testu kurczliwości w pierwszej kolejności jest podejmowana indywidualnie przez ośrodek diagnostyczny złośliwej hipertermii w konsultacji z pacjentem i jego płatnikiem opieki zdrowotnej¹⁸. Wytyczne ustalone przez Europejską Grupę ds. Złośliwej Hipertermii wymagają testowania kurczliwości przed testowaniem genetycznym w rodzinie³.