Badania laboratoryjne w diagnostyce SARS – RT-PCR i serologiczne

Badania laboratoryjne stanowią podstawę współczesnej diagnostyki SARS, umożliwiając precyzyjne wykrycie wirusa SARS-CoV oraz ocenę odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcję. Rozwój tych metod diagnostycznych nastąpił w rekordowo krótkim czasie podczas epidemii w 2003 roku, co pokazało zdolność nowoczesnej medycyny laboratoryjnej do szybkiej adaptacji wobec nowych zagrożeń epidemiologicznych¹.

Test RT-PCR – złoty standard diagnostyki SARS

Test odwrotnej transkrypcji z następową reakcją łańcuchową polimerazy (RT-PCR) jest obecnie uznawany za metodę z wyboru w diagnostyce SARS². Metoda ta pozwala na wykrycie specyficznych sekwencji RNA wirusa SARS-CoV w próbkach klinicznych poprzez amplifikację materiału genetycznego. Test RT-PCR charakteryzuje się wysoką specyficznością, co oznacza, że pozytywne wyniki z bardzo dużą pewnością wskazują na obecność wirusa SARS-CoV³.

Proces diagnostyczny za pomocą RT-PCR obejmuje kilka etapów: izolację RNA z próbki klinicznej, odwrotną transkrypcję RNA do DNA komplementarnego (cDNA), a następnie amplifikację specyficznych regionów genomu wirusa⁴. Światowa Organizacja Zdrowia opublikowała wiele protokołów obejmujących projektowanie primerów, które wiążą się ze specyficznymi obszarami genomu wirusowego i następnie je amplifikują⁴.

Jedną z głównych zalet testu RT-PCR jest możliwość generowania wartości progowej cyklu (Ct), która może dostarczyć informacji o ilości materiału wirusowego w próbce⁵. Jednak metoda ta wymaga specjalistycznych i kosztownych odczynników, drogiej aparatury laboratoryjnej oraz wykwalifikowanego personelu⁵.

Czułość i specyficzność testów RT-PCR

Skuteczność diagnostyczna testów RT-PCR w przypadku SARS jest zróżnicowana w zależności od rodzaju próbki oraz czasu jej pobrania. Badania wykazały, że protokoły RT-PCR dwóch laboratoriów sieci WHO wykazywały czułość diagnostyczną na poziomie 61-68% dla próbek pobranych z nosogardła, 65-72% dla wymazów z gardła, 50-54% dla próbek moczu oraz 58-63% dla próbek stolca, przy ogólnej specyficzności wynoszącej 100%³.

Istotnym ograniczeniem diagnostyki RT-PCR w przypadku SARS jest początkowo niska wirusemia, szczególnie w górnych drogach oddechowych we wczesnym okresie choroby⁶. W przeciwieństwie do innych wirusów układu oddechowego, gdzie szczytowe obciążenie wirusowe w wydzielinach z układu oddechowego obserwuje się w momencie prezentacji klinicznej, wczesna diagnostyka SARS-CoV jest utrudniona przez początkowo niskie obciążenie wirusowe w górnych drogach oddechowych⁶.

Z tego powodu zaleca się badanie więcej niż jednej próbki z układu oddechowego w celu maksymalizacji czułości testów RT-PCR dla SARS-CoV³. Dodatkowo, dla pacjentów z podejrzeniem objawów klinicznych zaleca się wielokrotne testowanie próbek o wynikach ujemnych, pobieranie próbek z wielu miejsc oraz standardowe pobieranie próbek przez wykwalifikowany personel⁷.

Badania serologiczne – wykrywanie odpowiedzi immunologicznej

Badania serologiczne odgrywają istotną rolę w potwierdzaniu klinicznych przypadków SARS oraz w ocenie infekcji o łagodnym lub nietypowym przebiegu⁶. Metody serologiczne wykrywają przeciwciała wyprodukowane przez system immunologiczny w odpowiedzi na infekcję wirusem SARS-CoV. Dostępne są różne techniki serologiczne, w tym test immunofluorescencji pośredniej oraz testy immunoenzymatyczne (ELISA)⁸.

Badania wykazały, że około 95% pacjentów z chorobą SARS-CoV wytwarza odpowiedź przeciwciałową przeciwko wirusowi⁹. Jednak optymalne okno czasowe dla badań serologicznych różni się od testów molekularnych. Chociaż niektórzy pacjenci mają wykrywalne przeciwciała koronawirusowe w ciągu 14 dni od wystąpienia choroby, definitywna interpretacja ujemnych testów na przeciwciała koronawirusowe jest możliwa tylko dla próbek pobranych 21 dni po wystąpieniu gorączki⁸.

W porównaniu do RT-PCR, badania serologiczne odgrywają również rolę w wykluczaniu infekcji przy użyciu odpowiednio pobranej próbki surowicy w okresie rekonwalescencji⁶. Testy serologiczne wymagają zarówno próbki surowicy z ostrej fazy choroby, jak i z okresu rekonwalescencji¹⁰.

Problemy z reaktywnością krzyżową

Jednym z wyzwań związanych z badaniami serologicznymi SARS jest możliwość reaktywności krzyżowej z innymi koronawirusami. Niedawny wybuch infekcji górnych dróg oddechowych koronawirusem OC43 w domu opieki, gdzie niektóre, ale nie wszystkie testy przeciwciał SARS-CoV dawały wyniki pozytywne, sugeruje, że reaktywność krzyżowa między SARS-CoV a innymi koronawirusami może występować w niektórych testach¹¹.

Głównym wyzwaniem w testowaniu serologicznym jest właśnie reaktywność krzyżowa przeciwciał z innymi grupami rodziny wirusów SARS¹². Dlatego laboratoria wykonujące specyficzne testy PCR na SARS powinny przyjąć rygorystyczne kryteria potwierdzania pozytywnych wyników, szczególnie w obszarach o niskiej prevalencji, gdzie wartość predykcyjna dodatnia może być niższa¹³.

Hodowla wirusowa – metoda uzupełniająca

Hodowla wirusowa stanowi trzecią metodę diagnostyki laboratoryjnej SARS, choć jest najmniej powszechnie stosowana w praktyce klinicznej. Wirus w próbkach (takich jak wydzieliny z układu oddechowego, krew lub stolec) od pacjentów z SARS może być również wykryty przez zakażenie hodowli komórkowych i hodowanie wirusa¹³. Po izolacji wirus musi zostać zidentyfikowany jako wirus SARS za pomocą dodatkowych testów¹³.

Wydajność izolacji wirusowej była znacznie niższa niż RT-PCR, a żadna próbka nie była pozytywna w hodowli, ale ujemna w RT-PCR¹⁴. Praktycznie rzecz biorąc, dla większości laboratoriów testy diagnostyczne ograniczają się do RT-PCR i serologii, ponieważ hodowla wirusowa może być przeprowadzana tylko w placówce o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego¹.

Interpretacja wyników i kontrola jakości

Właściwa interpretacja wyników badań laboratoryjnych wymaga uwzględnienia wielu czynników. Pojedynczy pozytywny test nie potwierdza rozpoznania ze względu na wysoką częstość wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie ujemnych¹⁵. W przypadku wyników pozytywnych zaleca się upewnienie, że wyniki fluorescencyjnej ilościowej PCR co najmniej dwóch celów w teście są pozytywne. Gdy tylko jeden cel jest pozytywny, należy w miarę możliwości poprosić o ponowne sprawdzenie, a nawet ponowne pobranie próbek⁷.

Kontrola jakości w diagnostyce laboratoryjnej SARS jest niezwykle istotna. Zaleca się ustanowienie jednej słabej pozytywnej kontroli jakości oraz trzech negatywnych kontroli jakości dla każdej partii testów. Wszystkie trzy negatywne kontrole jakości powinny być negatywne, a słaba pozytywna kontrola jakości powinna być pozytywna, co jest uważane za kontrolę tej partii testów⁷. W przeciwnym razie jest to poza kontrolą i nie można wydać raportu z testu, a w razie potrzeby należy wykonać ponowny test⁷.