Diagnostyka genetyczna i molekularna XLA – analiza genu BTK

Diagnostyka molekularna i genetyczna stanowi złoty standard w potwierdzaniu rozpoznania agammaglobulinemii związanej z chromosomem X. Ostateczne potwierdzenie diagnozy XLA można uzyskać poprzez wykazanie nieobecności białka BTK w monocytach lub płytkach krwi, lub poprzez wykrycie mutacji w genie BTK¹.

Analiza ekspresji białka BTK

Ekspresja białka BTK może być oceniona metodą cytometrii przepływowej i jest znacznie obniżona w XLA². Test ten można zazwyczaj ukończyć w ciągu tygodnia i może zapewnić szybką diagnozę dla podejrzewanego pacjenta². Analiza białka BTK w monocytach lub płytkach krwi metodą cytometrii przepływowej jest szybka, dokładna i mniej kosztowna³.

Wewnątrzkomórkowa ekspresja białka BTK w monocytach oceniana cytometria przepływową wykazuje znacznie obniżony średni wskaźnik fluorescencji, co potwierdza diagnozę XLA⁴. Ekspresja białka BTK może być również oceniana w monocytach lub płytkach metodą Western blot⁵.

Możliwe jest również wykonanie testu Western Blot w celu określenia, czy białko BTK jest wyrażane⁶. Ostatecznym wyznacznikiem XLA jest całkowita nieobecność RNA lub białka BTK⁷. Rzadko diagnoza jest stawiana u dorosłych w ich drugiej dekadzie życia, co jest prawdopodobnie spowodowane mutacją w białku, a nie całkowitą nieobecnością⁷.

Sekwencjonowanie genu BTK

Molekularne testowanie genetyczne może ustalić wczesną potwierdzoną diagnozę wrodzonej agammaglobulinemii oraz ułatwić wykrywanie nosicielek i diagnozę prenatalną⁸. Diagnoza XLA zostaje ustalona u mężczyzny z sugerującymi objawami i hemizygotycznym wariantem patogennym (lub prawdopodobnie patogennym) w BTK zidentyfikowanym przez molekularne testowanie genetyczne⁹.

Podejścia molekularnego testowania genetycznego mogą obejmować kombinację testowania ukierunkowanego na gen (testowanie pojedynczego genu, panel multigenowy) i kompleksowego testowania genomowego (sekwencjonowanie eksomu, sekwencjonowanie genomu)¹⁰. Analiza sekwencyjna BTK jest wykonywana w pierwszej kolejności w celu wykrycia wariantów missense, nonsense i miejsc splicingu oraz małych delecji/insercji wewnątrzgenowych¹⁰.

Analiza delecji/duplikacji ukierunkowana na gen wykrywa delecje lub duplikacje wewnątrzgenowe¹⁰. Analiza mikroskładowa chromosomów (CMA) z użyciem tablic oligonukleotydowych lub tablic SNP w celu wykrycia dużych delecji/duplikacji w całym genomie (w tym BTK), których nie można wykryć przez analizę sekwencyjną¹⁰.

Rodzaje mutacji i ich charakterystyka

Prawie każda rodzina ma inny wariant w BTK; członkowie tej samej rodziny jednak zazwyczaj mają tę samą mutację¹. Analiza mutacji BTK obejmująca eksony 1-19 na poziomie cDNA jest wykonywana w celu potwierdzenia diagnozy¹¹. Kombinacja analizy genetycznej przy użyciu cDNA i DNA genomowego może dostarczyć wglądu w mechanizm splicingu RNA BTK¹¹.

Najczęstszym typem mutacji jest przedwczesny kodon stop¹². Spektrum mutacji może różnić się między populacjami – badania pokazują, że mutacje w południowo-wschodniej Turcji mogą być różne od tych w pozostałej części świata¹³. Korelacja między konkretną mutacją w BTK a ciężkością choroby sama w sobie może nie być wystarczająca do przewidywania przebiegu klinicznego u pacjenta z XLA na podstawie mutacji¹².

Testowanie nosicielek i diagnostyka rodzinna

Testowanie genetyczne potwierdzone, że jedenaście matek i siedem sióstr było nosicielkami choroby, podczas gdy trzy mutacje były de novo¹⁴. Testowanie nosicielek dla kobiet w rodzinie jest dostępne poprzez molekularne testowanie genetyczne genu BTK, oprócz diagnozy prenatalnej (amniocenteza lub biopsja kosmówki) dla ciąż, w których matka jest znaną nosicielką¹⁵.

Testowanie genetyczne jest zazwyczaj zalecane dla krewnych pierwszego stopnia¹⁶. Jeśli mutacja została zidentyfikowana u członków rodziny, analiza mutacyjna próbek kosmówki, płynu owodniowego lub krwi pępowinowej może zapewnić diagnozę prenatalną¹⁶.

Molekularne testowanie genetyczne narażonych męskich krewnych tak szybko, jak to możliwe po porodzie, zapewnia, że osoby dotknięte chorobą otrzymają terapię zastępczą gammaglobuliną tak szybko, jak to możliwe¹⁷. Obecność brakującego limfocytu B u wuja ze strony matki lub męskiego kuzyna zasadniczo gwarantuje diagnozę¹⁷.

Diagnostyka prenatalna

Diagnostyka prenatalna jest dostępna dla rodzin, w których zidentyfikowano mutację powodującą XLA¹⁸. Prenatalny skring genetyczny jest zalecany dla osób, jeśli mutacja powodująca XLA została zidentyfikowana w ich rodzinie¹⁸. Badanie może obejmować amniocentezę lub biopsję kosmówki¹⁹.

Badanie w macicy poprzez biopsję kosmówki lub amniocentezę jest możliwe²⁰. Testowanie przy urodzeniu w celu wykrycia spadku limfocytów CD19 B i podwyższonego poziomu limfocytów T poprzez analizę cytometryczną²⁰. Te procedury pozwalają na wczesne wykrycie choroby i odpowiednie przygotowanie do leczenia.

Techniki molekularne

Specjalna analiza molekularna jest wykonywana metodą polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCP), bezpośredniej analizy DNA, elektroforezy żelowej z gradientem denaturującym lub odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy w celu poszukiwania mutacji BTK⁷. Analiza molekularna obejmuje techniki takie jak polimorfizm konformacji pojedynczej nici, analiza DNA, elektroforeza żelowa z gradientem denaturującym lub testy odwrotnej transkryptazy polimerazy na genie BTK²⁰.

Wyniki genetycznego testu krwi potwierdzają diagnozę i zidentyfikują konkretną mutację BTK, jednak jej koszt uniemożliwia jej wykorzystanie w rutynowych badaniach przesiewowych wszystkich ciąż⁶. Dlatego testowanie jest zazwyczaj ograniczone do rodzin z już potwierdzoną diagnozą XLA.

Znaczenie diagnostyki molekularnej w przypadkach atypowych

Kombinacja oceny cytometrycznej i analizy genetycznej BTK zapewnia ostateczną diagnozę dla pacjentów z XLA, szczególnie z atypiczną prezentacją kliniczną¹⁴. Diagnoza XLA jest czasami trudna, ponieważ niewielka liczba pacjentów ma wyższe poziomy immunoglobulin w surowicy niż oczekiwane²¹.

Opóźniona diagnoza wynika głównie z prawie prawidłowego poziomu IgG i prawidłowego poziomu IgA podczas pierwszego epizodu bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych²¹. Nieobecność limfocytów B nawet przy prawidłowym poziomie immunoglobulin w surowicy powinna ostrzec lekarzy o konieczności dalszego potwierdzenia możliwości XLA²¹. Analiza mutacyjna genu BTK jest ważna dla dokładnej diagnozy atypowych pacjentów z XLA²¹.