Diagnostyka laboratoryjna botulizmu – metody i interpretacja wyników

Diagnostyka laboratoryjna botulizmu stanowi kluczowy element potwierdzenia rozpoznania klinicznego, choć z uwagi na czas potrzebny na otrzymanie wyników, nie powinna opóźniać rozpoczęcia leczenia. Rutynowa diagnostyka laboratoryjna botulizmu opiera się na wykrywaniu toksyny botulinowej u pacjenta oraz wykrywaniu bakterii produkujących toksynę, co potwierdza diagnozę¹.

Test śmiertelności u myszy – złoty standard

Standardową procedurą wykrywania toksyny botulinowej pozostaje test śmiertelności u myszy (mouse lethality assay). Test ten opiera się na dootrzewnowym wstrzyknięciu myszy laboratoryjnych próbki rozcieńczonej w buforze fosforanowym². Typ toksyny określa się poprzez neutralizację toksyny za pomocą specyficznych antytoksyn².

Test bioassay na myszach charakteryzuje się bardzo wysoką czułością – jedna dootrzewna dawka śmiertelna dla 50% myszy odpowiada 5-10 pg, a granica wykrywalności wynosi 0,01 ng/ml eluatu próbki². Jednak test ten jest pracochłonny i kosztowny, a także przedstawia dylemat etyczny ze względu na użycie zwierząt laboratoryjnych².

W podejrzanych przypadkach klinicznych botulizmu, gdzie wymagane jest natychmiastowe leczenie, test na myszach może być również zbyt wolny do postawienia diagnozy². Dostępny test bioassay na myszach wymaga co najmniej sześciu mililitrów plazmy lub surowicy z dotkniętego konia przed leczeniem antytoksyną³.

Rodzaje próbek diagnostycznych

Potwierdzenie laboratoryjne botulizmu wymaga wyizolowania toksyny botulinowej lub wyhodowania gatunku Clostridium produkującego toksynę botulinową (tj. C. botulinum, C. baratii lub C. butyricum) w hodowli kału, aspiratu żołądkowego, żywności lub rany⁴.

Toksynę można zidentyfikować w następujących materiałach: surowicy, kale, wymiocinach, aspirat żołądkowy oraz podejrzanej żywności⁵. Ponieważ nosicielstwo jelitowe jest rzadkie (a jelita dorosłych zazwyczaj nie pozwalają na kiełkowanie), zidentyfikowanie organizmu lub jego toksyny w wymiocinach, płynie żołądkowym lub kale silnie sugeruje diagnozę⁶.

W przypadku botulizmu ran, hodowle ran, które wyhodowują C. botulinum, sugerują botulizm ran⁶. Odpowiednie próbki kliniczne do testowania toksyny botulinowej obejmują surowicę i kał, a wstępne wyniki mogą być dostępne w ciągu 18-24 godzin⁷.

Izolacja i hodowla bakterii

C. botulinum wymaga ścisłych warunków beztlenowych do wzrostu. Identyfikacja i izolacja C. botulinum z próbek o wysokim poziomie konkurencyjnej flory bakteryjnej, takich jak próbki kałowe i środowiskowe, są pracochłonne i czasochłonne⁸. Obecność nietoksycznych szczepów podobnych do C. botulinum zakłóca hodowlę C. botulinum⁸.

Na podłożu żółtkowym kolonie produkujące toksynę zwykle wykazują powierzchniową opalizację, która rozciąga się poza kolonię⁹. W przypadku toksykoinfekcyjnego botulizmu organizm można wyhodować z tkanek dotkniętych zwierząt¹⁰.

Nowoczesne metody immunologiczne

Opracowano wiele formatów testów immunologicznych do wykrywania toksyn botulinowych. Chociaż wiele z najwcześniejszych testów miało słabą czułość lub specyficzność, najnowsze osiągnięcia w amplifikacji sygnału umożliwiły uzyskanie czułości równej testowi bioassay na myszach².

Czułość konwencjonalnych testów ELISA do wykrywania toksyny botulinowej jest około 10- do 100-krotnie niższa niż test bioassay na myszach¹¹. Ograniczenia każdego testu należy mieć na uwadze – na przykład ELISA-ELCA, który wykorzystuje przeciwciała kurze i biotynylowane, nie nadaje się do badania żywności zawierającej mięso z kurczaka, żółtko jaja, białko jaja i mleko¹¹.

Właściwość toksyny botulinowej polegająca na posiadaniu bardzo specyficznej aktywności cynkowej endopeptydazy z wybranymi celami w szczelinie synaptycznej zainspirowała rozwój testów in vitro do wykrywania toksyny¹¹. Testy endopeptydazy opierają się na specyficznym rozszczepieniu białek synaptycznych przez różne toksyny botulinowe, w połączeniu z immunologicznym wykrywaniem rozszczepionego peptydu¹¹.

Metody molekularne i genetyczne

Metody wykrywania oparte na DNA przewyższyły techniki konwencjonalne, z licznymi protokołami molekularnego wykrywania opublikowanymi dla C. botulinum⁸. Techniki molekularnego wykrywania opierają się jedynie na wykrywaniu genu toksyny botulinowej w próbce, a zatem nie wykrywają aktywności genu ani toksyny⁸.

Wykrywanie molekularne metodą PCR unika czasu wymaganego do obliczenia minimalnej dawki śmiertelnej (MLD) i testu neutralizacji¹². Można wykonać testy molekularnego wykrywania obecności genów Clostridium botulinum i jego typu w podłożu hodowlanym¹².

Wykrywanie przeciwciał przeciwko toksynie

Wykrywanie przeciwciał przeciwko toksynie botulinowej ma znaczenie w następujących przypadkach: pacjenci leczeni rozcieńczoną toksyną botulinową, tacy jak ci otrzymujący botoks do celów estetycznych lub medycznych, w celu wykrycia obecności przeciwciał, które zapobiegają jej działaniu¹².

Akceptowaną metodą referencyjną do wykrywania i kwantyfikacji przeciwciał przeciwko toksynie botulinowej jest test neutralizacji u myszy (Mouse Neutralization Assay)¹³. Przed etapem testu neutralizacji konieczne jest obliczenie minimalnej dawki śmiertelnej (DLM) toksyny¹³.

Specyfika diagnostyki u niemowląt

Diagnostyka laboratoryjna botulizmu niemowlęcego jest procesem dwuczęściowym. Pierwszy składnik polega na przeprowadzeniu bezpośredniej analizy toksyny, co wymaga wyodrębnienia toksyny bezpośrednio z próbki kału i zastosowania specjalistycznych technik do identyfikacji i typowania toksyny¹⁴.

Druga część polega na hodowli kału przy użyciu specjalistycznych podłoży i technik w celu wyizolowania Clostridium botulinum. Próbki kału do badań diagnostycznych botulizmu niemowlęcego można pobierać przed lub po podaniu antytoksyny¹⁴.

W niektórych przypadkach botulizmu niemowlęcego sama obecność C. botulinum w kale lub treści jelitowej pacjenta może być wystarczająca do diagnozy, nawet jeśli toksyny nie można wykryć w próbkach od pacjenta¹⁵. Próbka kału powinna być pobrana do hodowli i testowania toksyny, ponieważ badania surowicy u niemowląt często dają wyniki fałszywie ujemne¹⁶.

Ograniczenia i wyzwania diagnostyczne

Potwierdzające testy botulizmu z testami toksyny botulinowej lub hodowlami C. botulinum są czasochłonne i mogą być mało czułe w diagnostyce botulizmu inhalacyjnego i w aż 32% przypadków botulizmu przenoszonych przez żywność¹⁷.

Poziomy krążącej toksyny są często poniżej progu wykrywalności dla tego testu³. Najdokładniejsza diagnoza pochodzi z możliwości zidentyfikowania bakterii w paszy konia lub środowisku, co jest bardziej prawdopodobne w ogniskach epidemicznych niż gdy tylko jeden lub dwa konie z posiadłości są dotknięte³.

Skrajnie wysoka skuteczność toksyny botulinowej wymaga rygorystycznych wymagań w celu zapewnienia bezpieczeństwa pracowników laboratoryjnych¹⁸. Wszystkie próbki muszą być potrójnie zabezpieczone w zatwierdzonym kontenerze transportowym i mieć etykiety substancji niebezpiecznych¹⁹.

Przyszłość diagnostyki laboratoryjnej

Pomimo że test śmiertelności u myszy pozostał standardowym testem do wykrywania toksyn botulinowych, nastąpił ogromny postęp w rozwoju testów alternatywnych w ciągu ostatniej dekady¹⁸. Najnowsze osiągnięcia w rozwoju testów skutecznie dążą do szybkości i czułości – najszybsze testy wykonuje się obecnie w ciągu 20 minut, a czułość testów przewyższa test bioassay na myszach¹⁸.

Jednak dalsze badania są uzasadnione, aby uzyskać szybkość i czułość za pomocą jednego testu, który optymalnie wykrywałby wszystkie siedem typów toksyny jednocześnie¹⁸. Głównym celem diagnostyki laboratoryjnej botulizmu jest osiągnięcie szybkiej diagnozy i uratowanie pacjenta²⁰.